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  • 郭江濤課題組發文解析人源鉀氯共轉運蛋白KCC2,3,4的冷凍電鏡結構

    來源 :基礎醫學系    發布時間 :2020-12-12    瀏覽次數 :605

    20201211日,浙江大學基礎醫學院郭江濤課題組在Science Advances雜志上發表論文Structures and an activation mechanism of human potassium-chloride cotransporters,報道人源KCC2、KCC3KCC42.9-3.6 Å高分辨率冷凍電鏡結構,揭示了KCC家族保守的N末端肽段自抑制現象,并提出了一種潛在的激活機制。

    陽離子-氯離子共轉運蛋白廣泛分布于所有的生物界中,具有非常重要的生理功能,包括調節細胞體積,承擔腎小管的重吸收作用,調節神經元細胞內部氯離子濃度和神經元的興奮性。根據轉運離子種類的不同,陽離子-氯離子共轉運蛋白可以分為三類:鈉鉀氯共轉運蛋白(NKCC)、鈉氯共轉運蛋白(NCC)和鉀氯共轉運蛋白(KCC)。人類基因組共編碼 2 個鈉鉀氯共轉運蛋白(NKCC1 NKCC2)、1 個鈉氯共轉運蛋白(NCC)和 4 個鉀氯共轉運蛋白(KCC1-4)。NKCCNCC利用細胞膜兩側的Na+濃度梯度將細胞外的Na+、K+、Cl-Na+、Cl-轉運至細胞內;KCC則由細胞膜兩側的K+濃度梯度驅動將細胞內的K+Cl-轉運至細胞細胞外。陽離子-氯離子共轉運蛋白的轉運底物為 Na+、K+ Cl-這些生命體內主要的陽離子和陰離子,故而它們在多項生命活動過程中發揮著重要的作用。

    鉀氯共轉運蛋白KCC1-4介導K+Cl-的耦合輸出,在各種生理和病理過程中發揮著重要的作用。KCC2維持神經元細胞中氯離子的正常水平,在γ-氨基丁酸和甘氨酸介導的抑制性神經傳遞中發揮著重要作用。KCC2突變會導致抑制性神經元內Cl-濃度升高,抑制性神經元易于去極化而引發動作電位持續發放,誘導癲癇發作。KCC2的突變會導致兩種類型的人類癲癇,一種是特發性全身性癲癇(Idiopathic Generalized Epilepsy,IGE),該類癲癇無腦部器質性或代謝性疾病表現, 與遺傳因素密切相關并以全面性發作為發作類型;另一種是嬰兒癲癇伴游走性局灶性發作(Epilepsy of Infancy with Migrating Focal Seizures,EIMFS),屬于癲癇性腦病。而KCC3在上皮細胞中介導Cl-的跨膜轉運,并參與腦脊液的產生。KCC3的功能異常會引起Andermann綜合癥,一種胼胝體發育不全的遺傳性運動和感覺神經病。編碼KCC3SLC12A6Andermann綜合癥的唯一致病基因,該疾病的臨床表型的嚴重程度與基因的突變類型有關。KCC3的突變還可以引發耳聾以及神經退行性疾病。KCC家族成員的重要功能決定了它們將是治療這些疾病的重要藥物靶點,因此KCC家族成員的結構以及調節機制成為了該研究領域的熱點問題。

    本研究中,作者報道了人源KCC2、KCC3KCC42.9-3.6 Å高分辨率冷凍電鏡結構。KCC2-4具有相似的整體結構、結構域交換二聚體組裝方式和向內構象。在該構象中,KCC2-4的二體組裝主要是靠C末端結構域的二聚化來維持,跨膜結構域對二體組裝貢獻較少(圖1)。在2.9 Å KCC4的高分辨率冷凍電鏡結構中,進一步驗證了之前該研究組在KCC1結構中確定的1K+2Cl-結合位點。

    1. KCC2,KCC3KCC4的二聚體結構。

    上:冷凍電鏡密度圖,下:卡通結構圖。

    KCC2-4的結構中,研究人員意外地發現,N末端肽段在面向胞質的腔中與跨膜結構域緊密結合,并與C末端結構域發生靜電相互作用。結構分析發現,N末端肽段一方面阻斷了底物離子的結合,另一方面限制了底物離子結合附近的構象變化,從而將KCC2-4鎖定在自抑制狀態(圖2)。這一自抑制效應進一步通過離子轉運活性實驗進行了驗證:當突變N末端肽段中與跨膜結構域作用的氨基酸時,KCC2的離子轉運活性顯著提升(圖2)。

    2. KCC2N末端自抑制。

    (A) KCC2單個亞基的卡通側視圖。胞外結構域和跨膜結構域用青色表示,N末端多肽用黃色表示,C末端結構域用粉色表示。(B-EN末端與跨膜螺旋和C末端結構域之間的相互作用;其中(E)顯示N2C末端結構域之間的靜電相互作用,分別顯示為卡通圖(左)以及表面靜電勢模式(右)。(F)用注射KCC2野生型和突變體cRNA的非洲爪蟾卵母細胞來檢測K+內流情況。

    此外,在結構解析的過程中,研究人員發現KCC存在著C末端結構域運動的現象。當C末端結構域與跨膜結構域之間發生相對運動時,N末端肽段與C末端結構域的靜電作用會被破壞,從而減弱了N末端肽段的結合。這暗示C末端結構域通過調節N末端肽段的自抑制作用來調節KCC家族成員的活性。研究人員通過與NKCC1的結構進行比較,進一步驗證了激活狀態下的KCCC末端結構域的運動狀態。

    在此基礎上,研究人員提出了KCC家族蛋白被激活的模型,在自抑制狀態下,N末端肽段結合在面向胞質的腔中,并將轉運蛋白鎖定在向內構象中。C末端結構域與N末端肽段的相互作用,穩定這種自抑制狀態。隨著跨膜螺旋TM12的旋轉和平移,N末端肽段與跨膜結構域和C末端結構域之間的相互作用被破壞,N末端肽段從面向胞質的腔中解離,KCC被激活(圖3)。

    3. KCC的激活模型。

    在自抑制狀態下,N末端肽段結合在面向胞質的腔中,并將轉運蛋白鎖定在向內構象中。C末端結構域與N末端肽段相互作用,并穩定這種自抑制狀態。隨著跨膜螺旋TM12的旋轉和平移,N末端肽段與C末端結構域之間的相互作用被破壞,N末端肽段從面向胞質的腔中解離,KCC被激活。

    本研究解析了KCC家族完整的結構,并發現N末端肽段自抑制現象。在未來的研究中,需要進一步探討體內生理狀態下自抑制的調控機理。同時,這一自抑制現象為設計KCC激動劑提供了思路:設計別構調控分子,減弱N末端肽段的結合,從而起到激活KCC的效果,為開發抗癲癇藥物提供結構基礎。

    本研究得到了自然科學基金面上項目、浙江省杰青和科技部重點研發計劃的支持。浙江大學基礎醫學院解媛博士和常圣海博士為共同第一作者;浙江大學基礎醫學院郭江濤研究員、天津大學生命學院葉升教授和美國范德比爾特大學Eric Delpire為共同通訊作者。

    郭江濤課題組一直致力于癲癇相關的膜蛋白的結構和調控機理研究。20191025日,郭江濤課題組在Science雜志上發表研究論文Cryo-EM structures of the human cation-chloride cotransporter KCC1,在國際上率先報道人源KCC1的結構,揭示了KCC家族的結構和離子結合位點,為進一步揭示鉀氯共轉運機理提供了基礎。202093日,郭江濤課題組在Cell Research上發表研究論文Molecular basis for ligand activation of the human KCNQ2 channel,在國際上首次報道人源鉀通道KCNQ2的冷凍電鏡結構,解析了抗癲癇藥瑞替加濱與KCNQ2復合物的結構,揭示了其激活機理。這些系統性的結構生物學研究為揭示癲癇病的發病機理提供了線索,也為開發抗癲癇藥物打下了堅實的基礎。

    原文鏈接:https://advances.sciencemag.org/content/6/50/eabc5883

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